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A En el proceso de configuración del sistema, los componentes tales como cebadores y enzimas están en exceso, pero las plantillas no están en exceso.Las moléculas de ADN plantilla entran aleatoriamente en cada pequeño sistema de reacción.Después de la amplificación por PCR, el sistema que contiene la plantilla completa la amplificación y el sistema no contiene la plantilla sin amplificación.
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A Causa: la cepa está mutada y la sonda actual no es adecuada para la detección;no se puede detectar el ácido nucleico causado por el método de extracción (falta de extracción completa de las bacterias, hongos, etc. incluidos en la muestra);
Verificación de exclusión: se puede verificar la extracción de ADN del cultivo, seguida de la amplificación con nuestras sondas;se recomienda que el hemocultivo y las pruebas de ácido nucleico sean de la misma muestra de sangre.
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A Estándar de juicio ≥ 3 gotitas positivas, pero para las gotitas positivas en el punto crítico, es necesario realizar un análisis en profundidad en combinación con materiales de control de calidad negativos/positivos.Cuando hay una línea vertical de señales, se considera una señal no positiva.
muestras de baja concentración, se puede seleccionar un búfer múltiple más alto para el ajuste de carga de la muestra.
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A Plasma: se recomiendan ≥ 2 ml, los componentes son relativamente simples y se elimina la contaminación del ADN humano.La composición del ácido nucleico es más simple y la concentración de ácido nucleico bacteriano es más alta, lo que es conveniente para la detección.
Nota: La velocidad de rotación no debe ser demasiado alta durante la centrifugación, de lo contrario, se producirá fácilmente la pérdida de bacterias intracelulares y se afectará el resultado final de la prueba;
Sangre entera: se recomiendan ≥4 ml, los componentes son relativamente completos y la consistencia con las muestras de hemocultivo es buena, pero hay contaminación del ADN humano.
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A Bacterias (bacterias grampositivas, bacterias gramnegativas), hongos invasores, virus.Al mismo tiempo, también se puede llevar a cabo la detección de genes de resistencia a fármacos.
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A Se recomienda configurar un experimento de control para la división.Cuando no está configurado, generalmente use la intensidad de fluorescencia de 3000 como punto de umbral, o use el grupo negativo como referencia para juzgar el positivo.Puede consultar la experiencia de la citometría de flujo para hacer una división.
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A La cuantificación de la fluorescencia se basa en la curva de amplificación.La señal de detección de cada ciclo se calculará mediante el logaritmo de 2 a la N potencia, que solo se puede utilizar para distinguir la diferencia de más de 2 veces.El sistema de PCR digital puede detectar diferencias de expresión génica tan bajas como 0,1 veces mediante la fórmula de cálculo de distribución de Poisson.
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A Para la frecuencia de mutación, la PCR digital puede alcanzar el 0,01 % o menos, y se puede lograr una copia única para los microorganismos;RT-PCR solo puede alcanzar el 1%.
