Introducción a la PCR digital

La PCR digital (DPCR) es la tecnología de PCR de tercera generación desarrollada después de PCR convencional y PCR cuantitativa en tiempo real (QPCR). Su principio central es dividir una mezcla de reacción que contiene moléculas de ácido nucleico objetivo en decenas de miles de unidades de micro-reacción independientes (como micro-doblets o microondas), con una amplificación de PCR individual que ocurre dentro de cada unidad.

Después de completar la amplificación, se realiza una detección de punto final (típicamente de una señal de fluorescencia) en cada unidad. La presencia o ausencia de una señal determina si esa unidad contiene la molécula de ácido nucleico objetivo. Al contar el número de unidades positivas y aplicar estadísticas de distribución de Poisson, el número de copias absoluto del ácido nucleico objetivo en la muestra original se puede calcular directamente.

La ventaja central de la PCR digital radica en su capacidad para la cuantificación absoluta sin dependencia de una curva estándar, lo que lleva a resultados más precisos y confiables. Además, tiene una mayor tolerancia a los inhibidores y demuestra una excelente sensibilidad en la detección de objetivos de abundancia extremadamente baja, como mutaciones raras, patógenos traza y ADN tumoral circulante (ADNm).

Estas características han permitido que DPCR muestre un enorme valor de la aplicación y potencial en la investigación en ciencias de la vida y el diagnóstico clínico, incluidos los campos como la biopsia de líquido tumoral, el diagnóstico prenatal no invasivo, la detección precisa de los patógenos, el análisis de expresión génica, la cuantificación de componentes transgénicos y la valoración de las normas de referencia.

Tipos de PCR digital

La PCR digital se puede clasificar ampliamente en tres tipos principales basados en el método de partición utilizado para separar la muestra en muchas unidades de reacción individuales:

PCR digital basada en gotas

Este método divide la mezcla de PCR en decenas de miles de pequeñas gotas de agua en aceite, cada una actuando como un microrreactor de PCR independiente. Las gotas se generan utilizando microfluídica y luego se someten a la amplificación de PCR. Después de la amplificación, las gotas se analizan individualmente para determinar la fluorescencia para determinar las particiones positivas o negativas. Este enfoque ofrece una cantidad muy alta de particiones y se usa ampliamente por su sensibilidad y precisión.

PCR digital basada en chips

En este enfoque, la mezcla de PCR se divide en decenas de miles de microcámaras o pozos en un chip o placa microfluídica. Cada pozo contiene un pequeño volumen que actúa como una reacción de PCR aislada. Después de la amplificación, la imagen o escaneo de fluorescencia lee la señal de cada partición. Los sistemas DPCR basados en chip a menudo integran la partición, la amplificación y la detección de muestras en un solo dispositivo.

Métodos híbridos

Estos incluyen tecnologías de la unidad de reacción basada en gotas y el método de escaneo basado en chips que combinan características de los sistemas basados en gotas y chips. La lluvia utilizó este método. Primero, se generan decenas de miles de gotas usando microfluídica, luego las gotas se extienden en una sola capa en un chip. Después de completar la reacción de PCR, las señales de fluorescencia se recopilan mediante imágenes de la misma manera que el método basado en chips.

Cada estrategia de partición aísla las moléculas de ácido nucleico en compartimentos de reacción separados, lo que permite el uso de estadísticas de Poisson para cuantificar con precisión las moléculas de ADN o ARN objetivo contando particiones positivas y negativas. La elección del método de partición afecta el número de particiones, volumen de partición, complejidad del flujo de trabajo y requisitos de instrumentos.

Estadísticas de Poisson en PCR digital

La distribución de Poisson es fundamental para la PCR digital porque modela la probabilidad de que cualquier partición dada contenga moléculas objetivo cero, una o múltiples. Al considerar estas probabilidades, las estadísticas de Poisson permiten la estimación precisa del número promedio de moléculas objetivo por partición. Específicamente, cuando se conoce el volumen promedio de cada partición (VP), el modelo Poisson se puede aplicar para calcular la concentración absoluta de moléculas de ácido nucleico diana por unidad de volumen.

La visión clave de la distribución de Poisson es que la fracción de particiones negativas (aquellas sin moléculas objetivo) refleja la probabilidad de moléculas cero en una partición, lo que permite el cálculo de la ocupación promedio (λ) en todas las particiones. Este enfoque corrige la posibilidad de que algunas particiones positivas contengan más de una molécula, evitando la subestimación de la concentración objetivo.

La medición precisa de cada variable (particiones positivas, particiones totales y volumen de partición) es esencial, ya que cualquier error puede afectar directamente la precisión de la determinación de la concentración de ácido nucleico. En general, la distribución de Poisson proporciona el marco estadístico que transforma los datos de partición positiva/negativa binarias en una cuantificación absoluta y altamente precisa de las moléculas objetivo en la PCR digital.

¿Cómo calcular copias/gotas y copias/µl en PCR digital?

El número total de copias de la molécula objetivo en todas las gotas válidas de una muestra se calcula multiplicando las copias de la molécula objetivo por gotas con el número de gotas válidas. Según el número conocido de copias de la molécula objetivo por gota (λ) y el volumen de gotas, también se pueden calcular las copias por microlitro.

Formulas for calculate copies/droplet and copies/µL in digital PCR

La concentración de ADN objetivo en la sangre original de 2 ml es de aproximadamente 35,846 copias/ml.

¿Cuál es el flujo de trabajo de la serie Digital PCR Dropdx?

El flujo de trabajo de PCR digital es simple. Por lo general, abarca las siguientes etapas:

1. Preparación de la mezcla de reacción

El flujo de trabajo de detección de PCR digital (DPCR) comienza con la extracción de ácido nucleico de la muestra para aislar el ADN o el ARN. Después de la extracción, los ácidos nucleicos purificados se mezclan con Mastermix de PCR, incluidos cebadores, sondas fluorescentes, nucleótidos, enzimas y un supermix especializado diseñado para la formación de gotas.

2. Carga de muestra

3. Generación de gotas y PCR

4. Lectura de chips y análisis de datos

¿Cuál es el flujo de trabajo de la serie Digital PCR RS32?

El sistema de PCR digital todo en uno RS32 ofrece un flujo de trabajo totalmente automatizado de 'muestra-in, result -ut '. Después de una simple preparación de la muestra y cargar la muestra en el chip, los usuarios solo necesitan establecer los parámetros requeridos. Una vez que el chip se coloca en la máquina RS32, todo el proceso de detección continúa automáticamente sin ninguna intervención manual adicional. Este proceso simplificado elimina la necesidad de pasos prácticos durante el análisis, logrando la automatización completa de la entrada de muestra a la salida de resultado.

Ventajas y limitaciones de la PCR digital

Ventajas:

Ventaja	Descripción
Cuantificación absoluta	Cuenta directamente las moléculas objetivo sin la necesidad de una curva o referencia estándar, mejorando la confiabilidad.
Alta precisión y reproducibilidad	Proporciona resultados más precisos y reproducibles, especialmente para objetivos de baja abundancia y pequeños cambios de pliegue.
Sensibilidad superior	Detecta concentraciones extremadamente bajas de objetivos, como mutaciones raras, patógenos traza y ADNmt.
Alta tolerancia a los inhibidores	La partición reduce el impacto de los inhibidores de la PCR, lo que permite una cuantificación robusta incluso en muestras desafiantes.
Sin dependencia de la eficiencia de amplificación	Los resultados se ven menos afectados por las variaciones en la eficiencia de PCR, lo que lleva a una cuantificación más precisa.

Desventajas:

Desventaja	Descripción
Rango dinámico más estrecho	El número limitado de particiones restringe el rango de concentraciones objetivo que se pueden cuantificar con precisión, lo que a menudo requiere dilución de la muestra para objetivos altamente abundantes.
Mayor costo	El equipo y los consumibles para DPCR son generalmente más caros que los de QPCR.
Menor rendimiento	DPCR típicamente procesa menos muestras por ejecución.
Variedad de kit de reactivos limitados	Los kits de reactivos comercializados todavía están limitados en variedad, y incluso menos kits han obtenido la calificación para su uso en hospitales.
Kits de reactivos no interquistables	Debido a que los métodos de partición difieren, los kits de reactivo de diferentes fabricantes de PCR digitales no son intercambiables.

Comparación entre PCR digital y QPCR

QPCR es ideal para experimentos de alto rendimiento con un amplio rango dinámico y resultados rápidos. Es cuantitativo, pero generalmente requiere curvas o referencias estándar, y su precisión puede verse afectada por inhibidores y eficiencia de PCR.

DPCR ofrece cuantificación absoluta sin estándares, sobresale en sensibilidad y precisión para objetivos de baja abundancia o raros, y es más tolerante a los inhibidores. La elección entre QPCR y DPCR depende de los objetivos del experimento, el tipo de muestra y la sensibilidad requerida.

Tabla comparativa: QPCR vs. DPCR

Característica/aspecto	PCR en tiempo real (QPCR)	PCR digital (DPCR)
Cuantificación	Relativo o absoluto (requiere curvas o referencias estándar)	Absoluto (no se requieren estándares ni referencias)
Formato de reacción	PCR a granel, volúmenes de reacción flexibles	Partición de muestra, volúmenes de partición fija
Impacto de eficiencia de PCR	Impactado por los cambios en la eficiencia de la PCR (datos recopilados durante la fase exponencial)	No afectado por cambios de eficiencia de amplificación
Tolerancia a los inhibidores	Propenso a inhibidores	Mayor tolerancia al inhibidor
Método de detección	Detección en tiempo real	Detección de punto final
Rango dinámico	Amplio rango dinámico	Rango dinámico más estrecho
Sensibilidad	Mayor variación, menos sensible a objetivos raros	Detecta pequeños cambios y objetivos raros, mayor sensibilidad
Reproducibilidad	Moderado, puede verse afectado por varios factores	Mayor reproducibilidad
Poder estadístico	Más bajo	Más alto
Madurez de protocolo	Protocolos bien establecidos	Fácil transición de QPCR, pero los protocolos aún se están desarrollando
Rendimiento	Alto	Más bajo

Comparación entre PCR digital (DPCR) y secuenciación de próxima generación (NGS)

La PCR digital (DPCR) y la secuenciación de próxima generación (NGS) son tecnologías complementarias en biología molecular y diagnóstico clínico. En lugar de competir, a menudo se usan juntos para maximizar la potencia analítica:

NGS es ideal para un amplio descubrimiento, identificando una amplia gama de variantes genéticas y biomarcadores sin conocimiento previo de mutaciones. Es fundamental para el DPCR integral que proporciona una validación ultrasensible y una cuantificación precisa de objetivos específicos, lo que lo hace adecuado para rastrear mutaciones conocidas o variantes raras con el tiempo, especialmente en el monitoreo de la respuesta al tratamiento.

Ngs	PCR digital	PCR digital
Límite de detección	10% -5% para WGS y WES	0.1%-0.001%
Análisis de datos	Soporte bioinformático extenso, exigente interpretación de datos	Directo
Requisito de conocimiento de mutación	Conocimiento previo de mutaciones no necesarias	Requerido
Alcance de la detección	Cientos a exoma entero o genoma completo	Limitado
Cuantificación	Semifantitativo	Cuantificación absoluta
Tipos de alteraciones detectadas	Alteraciones del número de copias, reordenamientos estructurales, SNV o Metilación cambia sobre genoma/paneles enteros	Posible en genes/regiones individuales
Tiempo de respuesta (TAT)	Largo	Corto
Costo	Alto	Bajo

Estas tecnologías a menudo se integran en los flujos de trabajo: NGS para el descubrimiento y el perfil, seguido de DPCR para el monitoreo sensible y cuantitativo de objetivos seleccionados. Esta sinergia es particularmente valiosa en medicina de precisión, oncología, monitoreo de enfermedades infecciosas y pruebas genéticas.

Aplicaciones de PCR digital

Citas

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2. Zhao Z, Wang Y, Kang Y, et al. (2024). Un estudio retrospectivo de la detección de patógenos de sepsis que comparan la PCR digital independiente del cultivo y el cultivo. Heliyon. 10 (6): E27523. doi: 10.1016/j.heliyon.2024.e27523.

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6. Dong L, Li W, Xu Q, et al. (2023). Un ensayo multiplex rápido de parásitos de malaria humana por PCR digital. Clin Chim Acta. 539: 70-78. doi: 10.1016/j.cca.2022.12.001.

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